Diabetologia：激活但系统受损的记忆Tregs在1型糖尿病患者进展缓慢的过程中逐渐扩展

从第一次浮现去甲自身血清到浮现1HG哮喘外科征状的的其发展不下在成年人时代就有非常好的详细描述，多个去甲自身血清特征性的成年人记事70%在血清转换后10年内罹患哮喘，而随访15年的成年人这一比不下增高到84%。相比之下于之下，占外科1HG哮喘一半以上的HG1HG哮喘的确诊有助于还不会取得更促使的科学研究。

越来越多的人开始适用分过渡期系统来定义1HG哮喘的的其发展：个体在浮现多种去甲自身血清时进入第1过渡期，浮现食欲异常时进入第2过渡期，浮现征状时进入第3过渡期。一些多发去甲自身血清特征性的个体，在1期和2期，的其发展较慢，并其发展为确诊的1HG哮喘。我们早先详细描述了一组成员在首次测定到多种去甲自身血清试样后非常少10年无哮喘的想像中慢的其发展者，这组成员症状人数少，但相似性非常明确。随后，我们注意到去甲自身蛋白特异性CD8+T细胞膜反应在的其发展加速的症状中都前提不共存，但在近来确诊和近十年共存的哮喘症状中都很容易测定到。这可能表明，与的其发展症状相比之下于，这些症状自身免疫反应的调控增强。

早期科学研究表明，尽管调控性T细胞膜(Treg)数量经常性，但哮喘症状共存一些有助于不足之处，其中都有数对IL-2的反应灵活性减小。此外，哮喘症状中都的震荡CD4+T细胞膜可能对调控增添抵抗性，表现为震荡T细胞膜的消除减弱，其本质产生的Treg和体外产生的诱导Treg，以及蛋白经历的CD4+T细胞膜中都IL-2反应减弱。本科学研究的最终目标是详细描述了CD4+调控性T细胞膜(Treg)在群集想像中加速的其发展者中都的相似性，他们的平均年龄组为43岁(31-72岁)，随访时间为18-32年。

方法：BOX科学研究是一项以青年人为基础的纵向科学研究，在21岁不限确诊的症状配偶中都定期检查1HG哮喘的凶险因素。我们早先详细描述了近十年加速的其发展者的相似性，他们保持多重去甲自身血清特征性超过10年，但不会浮现哮喘的外科征状，慢性或非顺利进行性自身免疫。随后，10名早先保持无哮喘并愿意提供大量体内试样的加速的其发展者纳入T和B细胞膜有助于分析方法。在目前的科学研究中都，8名慢的其发展者(SP组成员)，中都位年龄组43岁(31-72岁)，18 - 32岁中间的去甲自身血清特征性。所有的组织者都位处1HG哮喘的其发展的1期，尽管一些人随后失去了去甲自身血清对某些蛋白的特征性反应，然而，一名症状仍未位处2期非常少6年，但不会浮现外科征状，一名症状被病患为哮喘，该实验者72岁，在捕获实验试样时，其HbA1c升高到53 mmol/mol(7%)，在数据分析方法中都对该供体顺利进行了另行评估。裂解外周血单个核细胞膜(PBMCs)，采用多常量流式细胞膜心法和T细胞膜消除试验中评估供体中都Treg的基频、遗传和有助于。适用FlowSOM和CITRUS(聚类鉴定、比如说和回归)顺利进行无监理聚类分析方法，评估Treg遗传。

结果：与健康供体相比之下于，来自慢的其发展体的知觉CD4+T细胞膜的监理聚类表明，作用于的知觉CD4+ Treg基频增高，与糖皮质激素诱导的TNFR具体蛋白(GITR)传达增高有关。一名HbA1c升高的症状与的其发展加速者和也就是说的对照组成员相比之下于，Treg谱有所不同。有助于分析方法表明，与健康供体相比之下于，来自加速的其发展体的Treg介导的CD4+震荡T细胞膜消除微小受损。表现为对震荡CD4+T细胞膜CD25和CD134传达的消除增高。

左图1 全面性的遗传分析方法表明，CD4+Treg亚HG在慢的其发展缓冲区中都增高。由FlowSOM降解的Treg室，组织起来在来自所有供体的活CD4+CD45RA -细胞膜上。根据标上物传达鉴定出10个元簇:知觉T细胞膜_1;知觉T cell_2;知觉T cell_3;知觉T cell_4;CD49b知觉T细胞膜;HLA-DR + GITR +知觉T细胞膜;存储器Treg_1;存储器Treg_2;存储器Treg_3;和存储器Treg_4。(a)适用9个不同Treg标上降解的10个元簇的MST。每个节点推选一个一个大(100个一个大)，非常大的元一个大(10个元一个大)在节点组成员周围装裱。每个节点中都的点心左图声称单个标上的传达级别。(b)每个元聚类的热左图，以表明整体标上传达。(c, d)为HD组成员(c)和SP组成员(d)降解左图，以及FlowSOM识别的每个元簇的很薄。(e-l)相比之下金属量为每个metacluster盒等分(金属量> 0.05%)确定为HD和SP组成员:存储器Treg_2 (e),存储器Treg_3 (f),存储器Treg_4 (g), HLA-DR + GITR +知觉T细胞膜(h)、知觉T cell_1(i),知觉T cell_2 (j),知觉T cell_3 (k) n d CD49b知觉T细胞膜(l)。浅浅蓝色左上方推选**SP 606。**p< 0.01, Wilcoxon相加大写字母秩检验。此键适用于左图形部分(a)， (c)， (d)和d (e-l)

左图2 适用CITRUS的已经有属实，Treg基频的增高是的其发展加速的标志。分级制度门控(a - f)和柑橘分析方法(g-k)尤其SP组织者和也就是说的HD组织者在CD4+CD45RA−T细胞膜上的差异。(a)杂交CD25+ cd127 lotreg和CD25loCD127+T c e l群体的推选性左图。CD25+ cd127lotreg被CD39和FOXP3可溶性，然后通过HLA-DR和GITR传达顺利进行裂解，模拟FlowSOM群体。(b) HD(黑点)和SP(黑斑)组成员以及供体SP 606(浅浅蓝色)中都CD25+ cd127的基频汇总左图。(c-f) CD25+CD127loCD39+FOXP3+和CD25loCD127+门控偏序的盒等分;(c) HLA-DRloGITR−(存储器Treg_2)， (d) HLA-DRintGITRlo(存储器Treg_3)， (e) HLA- d RhiGITR+(存储器Treg_4)， (f) HLA- d RhiGITR+(HLA-DR+GITR+存储器T cell)。(g - i)柑桔簇折叠由(g) CD127， (h) CD25和(i) FOXP3传达气压左图例，圆圈值得注意的簇被识别为SP和HD缓冲区中间的不同。(j)盒等分表明了在SP(黑斑)和HD(灰点)组成员中都，CITRUS知觉Treg_3和Treg_4的相比之下金属量(比不下)。(k)灰度表明每个簇的遗传(粉红色)和Treg标上相比之下传达与历史背景传达(浅蓝色);上列，存储器Treg_3;下面一行，存储器Treg_4。历史背景与所有其他簇中都标上的传达有关。*p< 0.05， **p< 0.01, Wilcoxon相加大写字母秩检验

左图3 与健康献血者相比之下于，的其发展加速者知觉treg的GITR增高。每个知觉CD4+T细胞膜元簇(知觉T细胞膜_1;知觉T cell_2;知觉T cell_3;CD49b +知觉T细胞膜;HLA-DR + GITR +知觉T细胞膜;存储器Treg_2;存储器Treg_3;来自FlowSOM的memory Treg_4)测定每个传达标上的变化。(a,b)来自HD (a)和S (b)缓冲区的传达热左图(sp606不有数在内)。(c,d)知觉Treg_4元簇中都所有HD(灰色)、所有SP(浅蓝色)和SP 606(浅浅蓝色)的FlowSOM GITR传达串联，表明灰度(c)和汇总左图(d)。Wilcoxon相加大写字母秩和检验，p< 0.07(浅浅蓝色)所有供体有数，p< 0.05(浅蓝色)供体SP 606和也就是说的HD不有数在测试中都。(e,f) HLA-DRhiGITR+Tregs中都GITR传达，从分级制度门控，从所有HD(灰色)、所有SP(浅蓝色)和SP 606(浅浅蓝色)串联，表明灰度(e)和汇总左图(f) *p< 0.05, Wilcoxon相加大写字母秩检验

左图4 来自加速的其发展的CD4+ treg细胞膜控制震荡CD4+T细胞膜的灵活性减小。SP组成员用浅蓝色的两条路线和左上方声称，HD组成员用黑色的两条路线和左上方声称，浅浅蓝色的两条路线/左上方声称供体sp606。适用CD4+CD25+ Treg分选试剂盒对CD4+T细胞膜顺利进行分选。CD4+CD25−(此番者)被标上为CFSE, Treg按推论的比不下试样。用抗CD3 /28微珠还原细胞膜，培养3当晚顺利进行流式细胞膜心法测定。(a-d)与CD4+此番者相比之下应的treg培养(自体)(e-h) HD、SP或SP 606 Treg与HD此番者培养。(a,b,f) CFSE裂解(a,e)和CFSE消除倍数(b,f)。(c, d,h) CD25 (c,g)和CD134 (d,h)的消除倍数。适用特征性对照(作用于的鼓动细胞膜分别为treg)计算消除倍数。*p< 0.05， **p< 0.01， ***p< 0.001，重复测量双向方差分析方法。†p < 0.0 5 Bonferroni的事后多重尤其测试

左图5 震荡CD4+T细胞膜对加速的其发展的T细胞膜还原的消除非常脆弱。SP组成员用浅蓝色的两条路线和左上方声称，HD组成员用黑色的两条路线和左上方声称，浅浅蓝色的两条路线/左上方声称供体sp606。适用CD4+CD25+Treg分选试剂盒对CD4+T细胞膜顺利进行分选。CD4+CD25−(此番者)被cfsel标上，treg按推论的比不下试样。用抗CD3 /28微珠还原细胞膜，培养3当晚顺利进行流式细胞膜心法(CD25反染)和细胞膜因子分析方法。HD Treg与HD、SP或sp606此番者联合培养。(a,b) CFSE裂解(a)和CFSE消除前年(b)。(c,d) CD25消除前年(c)和CD134消除前年(d)。(e,f) IFN-γ(e)和IL-17A (f)在共培养中都的传达。***p< 0.001， **p< 0.01，重复测量双向方差分析方法。†p < 0.0 5 Bonferroni的事后多重尤其测试

结论：我们给出的结论是，来自加速的其发展子的还原知觉CD4+Treg在GITR传达中都取得了扩展和丰富，强调了促使科学研究Treg在1HG哮喘效用个体中都的异质性的全面性。

原意出处：

Boldison J, Long AE, Aitken RJ,et al.Activated but functionally impaired memory Tregs are expanded in slow progressors to type 1 diabetes.Diabetologia 2021 Oct 28